Mikroskop fluoresensi: prinsip-prinsip metode

Penyerapan dan re-emisi cairan anorganik dan organik cahaya lebih merupakan hasil dari pendar atau fluoresensi. Perbedaan antara fenomena adalah durasi interval antara penyerapan dan emisi fluks cahaya. Ketika fluoresensi dari proses ini terjadi hampir bersamaan, sementara pendar - dengan beberapa penundaan.

informasi sejarah

Pada tahun 1852, ilmuwan Inggris Stokes, pertama kali dijelaskan fluoresensi. Dia memperkenalkan istilah baru sebagai hasil dari eksperimen dengan fluorspar, yang memancarkan cahaya merah di bawah sinar ultraviolet. Stokes mencatat fenomena menarik. Hal ini ditemukan bahwa panjang gelombang radiasi neon selalu lebih besar dari aliran cahaya eksitasi.

Untuk mengkonfirmasi hipotesis pada abad ke-19 ada banyak eksperimen. Mereka menunjukkan bahwa berbagai sampel berpendar di bawah pengaruh sinar ultraviolet. Di antara bahan, antara lain, pernah kristal, resin, mineral, klorofil, simplisia, senyawa anorganik, vitamin, minyak. Penggunaan langsung dari pewarna untuk tes biologis baru dimulai pada tahun 1930

Mikroskop fluoresensi: deskripsi

Beberapa bahan yang digunakan dalam paruh pertama studi abad ke-20 dipamerkan spesifisitas yang tinggi. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Berkat kinerja yang tidak dapat dicapai oleh kontras metode, metode mikroskop fluoresensi telah menjadi alat penting dalam penelitian biomedis dan biologi. Sama hasil penting diperoleh, dan untuk bahan.

? keuntungan apa metode mikroskop fluoresensi? Menggunakan bahan baru telah menjadi mungkin dan pemilihan komponen submicroscopic sel yang sangat spesifik. Mikroskop fluoresensi dapat mendeteksi molekul tunggal. Berbagai pewarna memungkinkan identifikasi beberapa item sekaligus. Meskipun resolusi spasial terbatas batas difraksi dari peralatan, yang, pada gilirannya, tergantung pada sifat spesifik sampel, identifikasi molekul di bawah tingkat ini juga sangat mungkin. Berbagai sampel setelah autofluorescence iradiasi pameran. Fenomena ini banyak digunakan dalam petrologi, botani, industri semikonduktor.

fitur

Mempelajari jaringan hewan atau patogen seringkali rumit atau terlalu lemah atau sangat kuat tidak spesifik autofluorescence. Namun, nilai dalam studi mengakuisisi pengantar ke dalam komponen bahan bersemangat pada panjang gelombang tertentu dan memancarkan intensitas aliran cahaya yang diperlukan. Fluorochromes bertindak sebagai pewarna mampu mandiri melekat struktur (terlihat atau tidak terlihat). Sehingga mereka memiliki selektivitas tinggi ke target, dan hasil kuantum.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Mikroskop fluoresensi telah banyak digunakan sejak munculnya pewarna alami dan sintetis. Mereka memiliki profil intensitas tertentu dari emisi dan eksitasi dan ditargetkan untuk target biologis tertentu.

Identifikasi molekul individu

Seringkali, dalam kondisi ideal, Anda dapat mendaftarkan cahaya elemen yang terpisah. Untuk ini, antara lain, perlu untuk memberikan suara yang cukup rendah dari detektor dan latar belakang optik. molekul fluorescein gagal karena photobleaching dapat memancarkan hingga 300 ribu. Foton. Pada 20% efisiensi pengumpulan dari proses dan dapat mendaftarkan mereka dalam jumlah sekitar 60 ribu.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Mikroskop fluoresensi berdasarkan dioda avalanche atau perkalian elektronik, memungkinkan para peneliti untuk mengamati perilaku molekul individu melalui kedua, dan dalam beberapa kasus bahkan menit.

kompleksitas

Isu kunci dalam mendukung penindasan kebisingan latar belakang optik. Karena kenyataan bahwa banyak bahan yang digunakan dalam desain filter dan lensa menunjukkan beberapa autofluorescence, usaha para ilmuwan pada tahap awal yang berorientasi pada produksi komponen memiliki fluoresensi rendah. Namun, percobaan berikutnya telah menyebabkan kesimpulan baru. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Secara khusus, ditemukan bahwa mikroskop fluoresensi, berdasarkan refleksi internal total, memungkinkan untuk mencapai latar belakang rendah dan cahaya eksitasi intensitas tinggi.

mekanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Prinsip-prinsip mikroskop fluoresensi, berdasarkan pantulan internal total adalah penggunaan gelombang cepat berlalu dr ingatan atau cepat berlalu dr ingatan. Hal ini terjadi pada batas antara media dengan berbagai indeks bias. Dalam hal ini, sinar cahaya melewati prisma. Memiliki tinggi bias parameter indeks.

prisma berdekatan dengan larutan berair atau kaca dengan parameter yang rendah. Jika seberkas cahaya diarahkan pada hal itu pada sudut yang lebih penting, balok benar-benar tercermin dari antarmuka. Fenomena ini, pada gilirannya, menyebabkan gelombang nonpropagating. Dengan kata lain, medan elektromagnetik yang dihasilkan yang menembus ke dalam media dengan lebih rendah indeks bias parameter untuk jarak kurang dari 200 nanometer.

Gelombang cepat berlalu dr ingatan intensitas cahaya akan cukup untuk membangkitkan fluorophores. Namun, karena kedalaman yang sangat kecil, volume akan sangat kecil. Hasilnya adalah latar belakang tingkat rendah.

modifikasi

Mikroskop fluoresensi didasarkan pada refleksi internal total, dapat diimplementasikan dengan epi-pencahayaan. Hal ini membutuhkan lensa dengan aperture numerik tinggi (setidaknya 1,4, tetapi diharapkan bahwa mencapai 1,45-1,6), dan sebagian diterangi aparat lapangan. Yang terakhir ini dicapai dengan ukuran spot kecil. Untuk keseragaman yang lebih besar menggunakan cincin tipis, yang diblokir oleh sebagian dari sungai. Untuk sudut kritis, setelah itu ada refleksi total, kita perlu tingkat tinggi pembiasan media perendaman dalam lensa dan kaca penutup mikroskop.