Metode penelitian genetika molekuler

Untuk mengeksplorasi dan mengidentifikasi varian genetik dalam metode struktur DNA yang digunakan molekul. Untuk masing-masing daerah DNA, yang membahas wilayah ini dari kromosom, gen atau alel, metode berbeda. Mendasari setiap metode genetika molekuler terdiri beberapa atau manipulasi lain dari RNA dan DNA. Semua metode ini ditandai dengan kompleksitas yang sangat besar, tanpa kondisi laboratorium tidak dapat dilakukan, dan staf harus sangat berkualitas. Pekerjaan ini dilakukan dalam beberapa tahap.

tahap

Pertama, RNA atau DNA sampel yang akan diproduksi. Di sini, metode genetika molekuler dapat diterapkan untuk hampir semua bahan: setetes darah, leukosit, fibroblas budaya, mukosa (tergores), bahkan folikel rambut, - DNA dapat diperoleh dari setiap sampel. Sangat cocok untuk menggunakan metode genetika molekuler dan berbagai pilihan mereka dan telah DNA lama terisolasi disimpan beku. Tahap kedua adalah didedikasikan untuk akumulasi fragmen yang diinginkan (amplifikasi) DNA, karena membantu memastikan polymerase chain reaction in vitro (in vitro tanpa keterlibatan organisme hidup). Akibatnya, dipilih fragmen DNA mengalikan dengan reaksi berantai ini, dan jumlah meningkat DNA jutaan kali.

Langkah ketiga dalam metode penelitian genetik molekuler diasumsikan pembatasan dikalikan DNA (fragmentasi ini, merobek atau memotong). Pembatasan dilakukan dengan elektroforesis pada poliakrilamida atau gel agarosa. Metode ini molekul-genetik mempelajari fragmen DNA memungkinkan semua orang untuk mengambil posisi tertentu dalam gel. Setelah itu, gel diperlakukan dengan ethidium bromide, mampu mengikat DNA, penyinaran dengan sinar ultraviolet, maka kemungkinan untuk mengamati bagian luminescence. Molekul metode diagnostik genetik bervariasi dan banyak, tapi dua langkah pertama yang umum untuk semua. Tetapi untuk mengidentifikasi fragmen DNA, gel dapat diwarnai, dan banyak metode lain yang sudah ada.

jenis

Metode yang paling langsung dan luas untuk mendeteksi mikobakteri mungkin termasuk metode pembelajaran DNA genetik molekuler di atas. Esensinya adalah bahwa, dalam rangka untuk mengidentifikasi bahan rantai scan fragmen spesifik DNA patogen. teknik diagnostik genetika molekuler belum memiliki cara yang lebih efisien untuk mengenali penyakit seperti tuberkulosis. Menggunakan polymerase chain reaction (PCR), Anda dapat yakin bahwa DNA asli akan meningkatkan jumlah salinan dalam satu juta kali, yaitu, akan ada amplifikasi, dan itu akan menampilkan hasil. Tingkat sensitivitas sangat tinggi - lebih dari sembilan puluh lima persen, yang merupakan keuntungan utama dari metode ini.

Sisa dari metode molekuler-genetik dari penelitian tentang efektivitas hasil beberapa salinan harfiah dua kali lipat, karena dalam hal ini sampel penyusunan menunjukkan urutan oligonukleotida spesifik meningkat menjadi seratus enam kali. Bahkan diagnosis budaya tuberkulosis pada sistem pernapasan secara signifikan menurunkan sensitivitas. Inilah sebabnya mengapa obat modern didasarkan pada metode genetika molekuler diagnosis TB. Sebuah metode yang dijelaskan efektif terutama ketika berhadapan dengan patogen variabilitas antigenik tinggi, menentukan bahwa cara lain adalah jauh lebih sulit - membutuhkan khusus media nutrisi dan budidaya lama. metode genetik biokimia dan molekuler menghasilkan efek yang sangat berbeda pada hasil.

diagnosis tuberkulosis

Marshall PCR diagnosis TB yang paling sering menggunakan orang-orang urutan DNA yang spesifik untuk semua empat jenis penyakit. Untuk mencapai tujuan ini sering menggunakan primer yang mendeteksi urutan IS elemen (IS-986, IS-6110), sebagai elemen-elemen ini mencirikan spesies yang beruaya Mycobacterium tuberculosis dan selalu beberapa salinan hadir dalam genom. Juga ekstraksi DNA dapat dilakukan dari kultur murni dan Klinis (dahak dari pasien) dengan metode lainnya yang sesuai. Sebagai contoh, metode Boom ada di mana buffer lisis yang digunakan didasarkan pada tiosianat guanidin dan silika sebagai DNA pembawa. Jumlah pasien yang berbeda bakteriologis miskin meningkat setiap tahun, dan karena itu dalam praktek klinis telah membentuk tingkat yang sama sekali berbeda dari organisasi: Metode molekul-genetik mempelajari DNA telah memainkan peran utama dalam diagnosis.

Namun, kita harus mengakui bahwa itu bukan tanpa kelemahan. Metode PCR adalah penggunaan sering membawa sejumlah besar hasil positif palsu, dan alasannya adalah tidak hanya kesalahan teknis, tetapi juga fitur dari metode itu sendiri. Selain itu, dengan menggunakan metode diagnosis untuk menentukan kelayakan mikobakteri, yang telah diidentifikasi, itu hanya mungkin. Tapi kerugian ini bukan yang paling penting. metode genetika molekuler diagnostik PCR memerlukan risiko kontaminasi DNA mikobakteri. persyaratan sertifikasi untuk alasan ini bahwa untuk laboratorium PCR dirancang secara eksklusif keras, mereka membutuhkan tiga tempat terpisah. Teknologi PCR modern dan sangat kompleks, membutuhkan penggunaan peralatan yang tepat dan tinggi personil terlatih.

bacterioscopy

Ketika hasil diagnosis dari analisis harus dibandingkan dengan data lain: pemeriksaan klinis, radiografi, mikroskopi, tanaman dan bahkan menanggapi pengobatan khusus sangat penting. Dalam seri ini, studi PCR hanya salah satu komponen. Mendeteksi patogen dalam diagnosis dini dapat menjadi metode paling sederhana dan tercepat - bakteriologi.

Ada digunakan mikroskop cahaya (mewarnai Ziehl-Neelsen) dan fluorescent (pewarna fluorochromes). Keuntungannya adalah kecepatan smear hasil. Namun kelemahan yang tepat dianggap kapasitas terbatas karena sensitivitas rendah. Namun, metode ini diberikan rekomendasi WHO sebagai yang paling ekonomis dan tanah untuk mendeteksi pasien TBC. Deteksi metode bakteriologis mycobacteria memiliki nilai prediksi dan diperkirakan ekskresi kuantitatif bakteri. Jauh lebih percaya diri untuk menghadapinya molekul metode penelitian genetik tuberkulosis.

budaya

deteksi yang lebih baik dari mikobakteri mengakui kajian budaya. Menabur bahan patologis dibuat ke dalam media telur: Mordovsky, Finn II, LJ, dan sejenisnya. Tolok ukur ketahanan mikobakteri untuk obat-obatan dan bukti tidak langsung dari efektivitas sejumlah mikobakteri dan koloni mereka in vitro, jika metode yang diterapkan dari budaya penelitian. Untuk meningkatkan persentase isolasi mikobakteri inokulasi bahan patologis diselenggarakan pada beberapa lingkungan.

Memenuhi kebutuhan berbagai budaya, patogen termasuk hibah dan cairan. Digunakan dalam sistem ini dan otomatis jenis metering pertumbuhan VANTES. Tanaman harus diadakan di inkubasi selama tujuh sampai delapan minggu. Pada saat ini tanaman dengan kurangnya pertumbuhan dapat dianggap negatif. Cara yang paling efektif untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis mempertimbangkan sampel biologis: Bahan menginfeksi babi guinea diagnostik, yang sangat rentan terhadap TB.

beberapa tokoh

bidang menarik studi, yang dibuka oleh diagnosa PCR adalah untuk mempelajari M. tuberculosis - infeksi laten. Konsep modern infeksi TB menunjukkan bahwa dari seratus orang yang kontak dengan M. tuberculosis, sembilan puluh mungkin terinfeksi, tetapi hanya sepuluh dari mereka adalah penyakit aktif sedang dikembangkan. Lainnya memiliki kekebalan TB, dan karena sembilan puluh persen dari kasus infeksi tetap laten. Mendeteksi pola itu telah membantu metode genetika molekuler.

Para ahli genetika mengatakan bahwa lima puluh lima persen dari mereka yang tanaman patologis materi negatif, dan delapan puluh persen orang yang terinfeksi M. tuberculosis, tetapi mengalir tanpa manifestasi radiografi penyakit, PCR respon positif yang diterima. Ini adalah metode diagnostik genetik membantu untuk mengidentifikasi pasien yang berisiko oleh penelitian PCR, dengan hasil analisis mereka (mikroskop dan budaya) yang negatif, dan infeksi subklinis M. tuberculosis hadir.

penelitian modern

Federasi Rusia dan laboratorium bakteriologi menggunakan metode dipercepat konsentrasi mutlak: aktivitas nitrat reduktase mikobakteri diuji oleh Griess reagen. pusat anti-TB menggunakan metode yang memungkinkan untuk menentukan resistensi obat. pembenihan ini dalam media cair, di mana otomatis radiometrik dan sistem akuntansi neon pertumbuhan mikobakteri. Analisis tersebut dilakukan dengan cepat - hingga dua minggu.

Saat ini, metode baru yang sedang dikembangkan: resistensi obat mikobakteri diukur pada tingkat genotipe. Studi mekanisme molekuler gen resistensi dan menunjukkan kehadiran di mycobacteria. gen ini terkait dengan resistensi terhadap obat-obatan tertentu. Sebagai contoh, gen Kasa, Inha, katG tahan terhadap isoniazid, gen rpoB - gen RNA 16Sp rifampisin dan rpsL - streptomisin, emb1 - untuk etambutol, gyrA - fluorokuinolon dan sebagainya.

mutasi

Diagnosis yang modern secara signifikan meningkatkan metode tingkat molekuler-genetik untuk mempelajari DNA dan memungkinkan untuk melakukan penelitian skala besar mutasi pada semua spektrum mereka. Sekarang kita tahu bahwa mutasi paling umum di 516, 526 dan 531 kodon gen rpoB, dan mengidentifikasi resistensi terhadap berbagai obat. Ada berbagai macam metode untuk mengetik mikobakteri menggunakan tidak hanya metode tradisional - biokimia, biologi dan budaya, tetapi juga banyak digunakan teknik genetika molekuler modern. Sudah ada cukup dan memberikan metode diagnosis yang benar untuk mendeteksi penyakit monogenik. Mereka didasarkan pada penelitian DNA di daerah yang tepat dari gen tertentu. Ini biasanya merupakan proses yang kompleks, memakan waktu dan mahal, tetapi data yang disediakan oleh analisis genetika molekuler, jauh lebih akurat dan informatif dari data semua analisis lainnya.

Hal ini telah lama diketahui bahwa DNA tidak berubah untuk seluruh kehidupan organisme yang berada dalam sel-sel odnakova berinti, dan ini memungkinkan untuk mengambil analisis benar-benar semua sel tubuh, pada setiap tahap ontogeni. gen yang rusak dapat dideteksi sebelum munculnya gejala pertama ke penyakit klinis skala penuh, serta pada orang heterozigot sehat, tetapi memiliki mutasi pada gen. metode diagnostik penyakit keturunan genetika molekuler memungkinkan untuk mengungkapkan nya (pendekatan langsung, DNA-diagnostik), serta untuk menganalisis pemisahan penyakit dalam keluarga dengan marker lokus DNA (polimorfisme genetik), yang terkait erat dengan gen yang rusak (yaitu, pendekatan tidak langsung dari DNA-diagnostik). Langsung atau tidak langsung - setiap diagnostik DNA didasarkan pada metode mengidentifikasi sebagian didefinisikan secara ketat dari DNA manusia.

metode langsung

metode langsung dari diagnosis DNA adalah ketika gen penyebab penyakit keturunan diketahui, juga dikenal, dan jenis mutasi nya. Sebagai contoh, sebuah metode langsung cocok di sejumlah penyakit. Ini chorea Huntington (ekstensi CTG-mengulangi), fenilketonuria (R408W), cystic fibrosis (delF508, mutasi besar) dan sejenisnya. Keuntungan utama dari metode langsung adalah akurasi diagnostik yang dimiliki sepenuhnya, dan tidak perlu untuk melakukan analisis DNA dari sisa keluarga. Jika mutasi pada gen yang sesuai ditemukan, itu memungkinkan persis menyetujui diagnosis faktor keturunan, genotipe tekad untuk sisa keluarga terbebani.

Keuntungan lain dari diagnosis langsung dianggap untuk mengidentifikasi pembawa heterozigot mutasi buruk dari kerabat dan orang tua yang meninggal akibat penyakit ini. Hal ini terutama berlaku untuk penyakit autosomal resesif. Kekurangan dari metode langsung juga tersedia. Untuk menerapkannya, Anda perlu tahu persis melokalisasi gen abnormal, struktur ekson-intron spektrum dan mutasi nya. Tidak semua penyakit monogenik hari ini telah menerima informasi tersebut. metode langsung informativeness tidak dapat dianggap lengkap, karena satu dan gen yang sama mungkin memiliki sejumlah besar mutasi patologis yang menyebabkan perkembangan penyakit keturunan.

metode tidak langsung

metode tidak langsung dalam diagnosa DNA digunakan sama sekali, dalam kasus lain, jika gen yang rusak tidak diidentifikasi, tetapi hanya kromosom, atau jika diagnosis garis tidak memberikan hasil (itu terjadi, jika gen organisasi molekul kompleks atau sebagian besar, jika ada banyak mutasi patologis). metode tidak langsung dilakukan analisis segregasi penanda polimorfik dalam keluarga alel. Penanda ditemukan di daerah kromosom yang sama atau lokus terkait erat dengan penyakit dan mewakili penghapusan atau sisipan, substitusi titik, mengulangi, dan polimorfisme mereka adalah karena jumlah yang berbeda dari sel-sel di blok tersebut.

Yang paling nyaman untuk diagnosis dianggap mikrosatelit dan minisatelit polimorfisme tidak langsung, yang secara luas didistribusikan dalam genom manusia. nilai mereka dinyatakan dalam isi informasi yang tinggi, jika kerusakan pada jarak genetik antara penanda dan gen yang tidak terlalu besar. Dalam kasus terakhir, akurasi estimasi ditentukan untuk sebagian besar frekuensi rekombinasi antara penanda polimorfik dan kerusakan. metode diagnostik tidak langsung juga menyediakan langkah awal wajib frekuensi alel dari studi populasi dianalisis antara pasien dan operator mutasi, ditambah perlunya menentukan probabilitas rekombinasi nonequilibrium dan adhesi spidol dan alel mutan.

metode lain

segmen pendek RNA atau DNA, serta gen tunggal divisualisasikan di bawah studi mikroskopis tidak bisa, karena itu, untuk mengidentifikasi mutasi yang dibutuhkan oleh diagnosis genetika molekuler. Ada "Human Genome Project", serta kemajuan lain dalam genetika molekuler sangat memperluas kemungkinan diagnosis penyakit keturunan - baik sebelum dan setelah melahirkan. Metode ini dapat memberikan deteksi dini dan membuat poli- prediksi dan penyakit monogenik, yang debut berlangsung di masa dewasa. Sayangnya, karena kemampuan teknis studi genetika molekuler kadang-kadang di luar batas etika yang ditetapkan dalam kaitannya dengan warisan, terutama ketika diagnosis pada masa remaja dan masa kanak-kanak.

Struktural dan numerik kelainan kromosom adalah penyebab paling umum dari penyakit dan kanker, dan banyak malformasi. penyimpangan kromosom perlu diidentifikasi, yang penting untuk konseling keluarga - untuk menilai perkiraan, bersama dengan risiko reproduksi pada kehamilan berikutnya. analisis kromosom adalah "standar emas" dari diagnosis genetik, tetapi terbatas. Hanya metode analisis genetika molekuler bisa berbuat lebih banyak, karena ada digunakan teknologi kloning berdasarkan label neon mampu sensitivitas tinggi mereka untuk mengidentifikasi perubahan kromosom halus yang tidak mungkin untuk mendeteksi klasik studi sitogenetik. Teknik ini semakin memperluas kemampuan diagnostik kami, ketika diperiksa, anak-anak cacat perkembangan, keterbelakangan mental, dengan banyak penyakit keturunan lainnya.

temuan

Hal ini sangat penting bagi umat manusia adalah struktur dan fungsi gen pengetahuan, jenis variabilitas, kemampuan untuk mendeteksi penyakit keturunan yang terjadi sehubungan dengan pengembangan genetika molekuler. metode-metode yang ditujukan pada studi molekul DNA - dan ketika itu adalah normal, dan ketika sudah rusak. Persiapan urutan asam deoksiribonukleat nukleotida (DNA) meluas dalam tahap menerima sampel untuk mengidentifikasi fragmen individu. Isolasi DNA genom dari sel, pembatasan (robek), amplifikasi (kloning), elektroforesis fragmen (memisahkan muatan listrik dan berat molekul dengan gel agarosa). Identifikasi fragmen spesifik yang terletak pada permukaan garis diskrit.

Kemudian masuk ke tindakan filter khusus, melalui yang melewati masing-masing hibridisasi fragmen dengan fragmen DNA kloning atau probe radioaktif sintetis adalah kontrol, yang akan sama dengan masing-masing sampel uji. Jika Anda mengubah posisi atau panjang dibandingkan dengan probe, jika fragmen baru atau menghilang - semua ini menunjukkan bahwa gen dianalisis telah mengalami restrukturisasi di urutan nukleotida. Ada delapan teknik dasar studi genetika molekuler: sequencing (penentuan urutan DNA), polymerase chain reaction (peningkatan jumlah urutan), persiapan primer dikenal gen, DNA kloning, produksi molekul rekombinan berasal protein karena molekul rekombinan, menciptakan satu set lengkap (koleksi perpustakaan) kloning fragmen yang diperoleh dengan menggunakan pembatasan.